活细胞成像仪在细胞相关实验中的应用，可以进行细胞培养和生长曲线监测、细胞监测实验、细胞划痕实验、细胞增殖实验、细胞调亡实验、细胞共培养实验、细胞毒性实验等。

● 细胞划痕实验protocol及注意事项：

（1） 实验目的

1）探究细胞迁移运动

2）探究细胞修复能力

3）探究细胞间相互作用

（2） 实验原理

细胞迁移(Cell migration)：也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。它参与到很多生理和病理的活动中，如下：

①免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一；②炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症部位并发挥其吞噬和组织损伤作用；③肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后随脉管系统实现远处转移；④损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参与消炎和凝血；⑤胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的正常发育。

细胞划痕实验（Cell scratch assay）是通过在细胞单层上划痕并通过延时显微镜定期捕获图像，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用的实验室技术，基本原理是：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合，于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验(Wound healing assay)。可用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移、修复和相互作用的影响。

（3）仪器和试剂

1）仪器：细胞计数仪、台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪、移液管移液器、4℃和-20℃冰箱、6孔培养板、直尺、maker笔。

2）试剂：细胞适配培养基、FBS、PBS、胰酶、样本溶剂。

（4） 实验步骤

1）划线：先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；

2）铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板；细胞铺板6w/孔，接种原则为过夜后融合率达到100%，每孔最终的培养基总量2mL；

3）细胞培养37℃、5％CO2培养箱中培养24h；

4）划痕：第二天用200微升枪头比着6孔板盖子或直尺，平行或垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜

5）清洗：PBS冲洗细胞3次，除去划下的细胞，加入无血清培养基；

6） 拍照：擦去6孔板背后的marker横线划痕。4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，加入待测样本，设置浓度梯度，可按0，6，12，24h时间点取样，拍照。

7.）结果分析，使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值或者划痕面积均值。

8）数据处理：

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始划痕面积-t时刻划痕面积)/初始划痕面积

细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始细胞间距离均值-t时刻细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值

（5）注意事项

1）划线的目的只是为了辅助划痕时划的更直，有利于后续拍照分析，划线会在拍照前擦去。

2）细胞接种数量需根据细胞生长速度和状态而定，接种原则为过夜后融合率达到100%，即细胞间没有空隙，否则会影响后续拍照分析。

3）同浓度不同孔之间划痕最好使用同一只枪头，减少划痕距离的误差。划痕时枪头垂直，不能倾斜，可比着直尺或孔板盖，保持力度一致，一次性划完。

4）冲洗时要温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞，反复多次冲洗，尽量洗掉所有的细胞碎片。

5）降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：①使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响；②一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；③如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1µg/ml)处理1h，抑制细胞的分裂。

6）尽量保证各个划痕宽度一致, 人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷，有条件的同学可以选择culture Insert（如下图），将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500um、1000um宽度的划痕。