培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。 计数结果以每毫升细胞数表示。 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果量需要计。

一、计数方法分类

第一类方法是直接计数法，利用耗材、设备，配合人工或自动化完成细胞数量的计数。包括：血球计数板计数法、细胞计数仪和流式细胞仪。

其中细胞计数仪的原理又可以分为基于阻抗检测细胞个数，和基于成像分析进行计数，而流式细胞仪是利用散射光对管道内的细胞进行计数。

第二类方法是间接计数法，最常见的有MTT，结晶紫染色、考马斯亮蓝染色法等。他们的原理基本上是依靠染色剂对细胞或细胞核进行染色，然后配合机器读取吸光值变化或人工观察计算细胞核数量来完成计数。

我们的日常实验中，有大量需要计算细胞密度，从而进一步计算接种浓度或数量的情况。如下图所示，为一块血球计数板 (Hemocytometer)，即我们常用的经典的细胞计数工具。

在血球计数板上，刻有一些符号和数字，XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格（即汤麦式）。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm，每个小方格的面积为1/400mm²。

二、计数步骤

1.准备细胞计数板：

在准备计数的细胞悬液之前，我们需要提前擦拭干净计数板。所谓干净的标准，就是在镜下观察计数板，见计数池内没有影响后期观察的纤维或杂点。使用大量75%乙醇喷洒计数板，令流动的乙醇带下计数板上的灰尘及细碎纤维（文明操作，在乙醇流下的地方垫上干净的布，或用废液缸接着，不要流的到处都是）。使用一块干净柔软的布（例如眼镜布）擦拭干净计数板和盖玻片，将盖玻片覆盖在计数板的计数池上方，将计数板转移入超净台。

2.准备细胞悬液，接入细胞计数板：

超净内消化细胞。取50~100μl的细胞悬液（必要时可提前将细胞悬液稀释10倍或更高倍数），在上下两个计数池的盖玻片的边缘滴上一滴细胞悬液，令其虹吸进入计数池。强调动作稳定，勿推动盖玻片。因为细胞计数并不需要严格无菌操作，因此可使用左手食指稳住枪头，再滴液体。再强调一点，左手食指可以接触枪头，但如前文细胞培养中所述，一定不能接触枪柄部分，以免影响后面细胞培养的无菌操作。

细胞悬液进入计数池后，静置片刻，将计数板稳定地转移至显微镜下进行计数。强调稳定，是为了避免因为晃动导致细胞悬液不均匀，甚至晃出计数室。

3.显微镜下的细胞计数板：

镜下可见的计数池如下图所示，分为两种。本文以汤麦式为例。

计数板由H形凹槽分为上下两个计数池。将盖玻片覆盖在两个计数池上方，形成深度为0.10mm的计数池。每个计数池又分为9个大格（下图红色边框大方格），每个大格规格为1.00mm×1.00mm。其中，中央大方格又用双线划分为25个中方格（下图绿色边框中方格或图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16个小方格（下图蓝色边框小方格）。

4.计数方法：

（1）推荐计数方法1：

如步骤3所述，推荐计数大方格（红色边框大方格）内的细胞数量，两个计数池一共有8个大方格，计得数量记为N。计数原则：计上不计下，计左不计右。

则细胞悬液密度为：C1=(N/8)×104个/ml

推导：前述可知，每个大方格的容积为0.1mm3，即0.1×10-3cm3，即0.1×10-3ml，即C1=（N/8）/（0.1×10-3ml）=(N/8)×104个/ml

若计数前，细胞悬液稀释倍数为M，则修正的细胞悬液密度为C=(N/8)×M×104个/ml

（2）备选计数方法2：

记中方格（绿色边框中方格）细胞数量，两个计数池共10个中方格，计得数量记为X。

则细胞悬液密度为：C2=(X/2)×5×104个/ml。

（3）两种方法比较：

方法1计数面积较大，因此计数更为准确，方法2计数面积较小，在细胞数量较多的情况下，计数速度更快。方法的选择嘛，仁者见仁智者见智。

三、活细胞成像仪自动计数

传统计数方法不仅操作步骤繁多复杂，而且对细胞计数也会产生细胞损伤。

相比较之下，活细胞实时成像仪通过单个细胞面积计算细胞总量的方法就更加简便，可以最小化对细胞的干扰损伤，最大化实验效率。

在培养箱稳定的环境中进行灵敏、实时的活细胞分析，获得有意义的数据。

使用经实验室验证的方案和直观的专用软件，从而缩短解决问题的时间，将更多时间用于研究。

利用荧光试剂组合（可与多种细胞培养模型和应用兼容）从每个样本中获得数据丰富的信息。

通过无干扰、基于图像的分析和专有的试剂保持细胞健康。